استرپتوکیناز: استخراج،کلون سازی و بیان بالای پروتئین نوترکیب فعال

چکیده سابقه و هدف: استرپتوکیناز به عنوان شناخته شده ترین داروی فیبرینولیتیک، مدت مدیدی است در درمان سکته قلبی استفاده می شود. ویژگیهای ساختاری ساده این پروتئین زمینه لازم برای دستیابی به انواع نوترکیب آن را فراهم ساخته است. هدف از این تحقیق تهیه سوش استرپتوکوک equisimilis h46a (پربازده از نظر تولید استرپتوکیناز) برای اولین بار در ایران بود تا پس از استخراجdna ، ژن استرپتوکیناز بگونه ای تکثیر شود که امکان کلون سازی آن در حاملهای متعدد بوجود آید. روش بررسی: پس از استخراجdna ژنومی ژن استرپتوکیناز از دو ناحیه با استفاده از دو پرایمر بالادست و یک پرایمر پایین دست ضمن در نظر گرفتن یک جایگاه آنزیم برش دهنده معمول برای دو سر محصولات (کل orf، bp 1323 و قسمت مربوط به پروتئین بالغ، bp 1245) تکثیر شد و در حامل pgex-4t-2 تحت پروموتور قوی t‏ac و قابلیت بیان بالا کلون شد. پلاسمید نوترکیب حاصل بوسیله عملیات هضم دو طرفه و تعیین توالی، تأیید و در اشریشیاکلی سویهbl21(de3 )plyss´ ترانسفورم شد. میزان بیان و فعالیت استرپتوکیناز نوترکیب مربوط به کلون واجد قطعه bp1245 با استفاده از دانسیتومتر لیزری و تست اختصاصی با سوبسترایs2251 در مقایسه با یک نمونه استرپتوکیناز خارجی مورد ارزیابی قرار گرفت. یافته ها: استفاده از یک آنزیم برش دهنده برای دو سر قطعه ژن، کلون شدن آن را در تعداد زیادی از حاملهای بیانی امکان پذیر ساخت. میزان بیان پروتئین نوترکیب به بیش از 45% کل پروتئینهای میزبان، موفقیت در کلون سازی را تأیید کرد. وجود دم اتصالی گلوتاتیون s ترانسفراز(gst) مانع فعالیت استرپتوکیناز نشد و مقدار آن بدون بهینه سازی و تخلیص شرایط کشت بیش از u/ml15000از کشت ثبت شد. نتیجه گیری: استفاده از حاملpgex-4t-2 ضمن تولید استرپتوکیناز نوترکیب فعال و با بازدهی فراوان، دم gst را نیز به ابتدای آمینی آن اضافه می کند که می توان از آن برای تخلیص یک مرحله ای و آسان با استفاده از لیگاند گلوتاتیون سود برد.